مقاله مقدمه‌ای بر بیوتکنولوژی انتقال ژن در ماهی در 50 صفحه ورد قابل ویرایش 

فهرست مطالب

عنوان                                                                                                                            صفحه

بخش اول: دست کاریهای ژنی در ماهیان

مقدمه................................................................................................................

1-1- به کار گیری پروموتر از ژن ماهیان.....................................................

2-1- بیان ژن هورمون رشد ماهی در باکتری...............................................

3-1-  انتقال ژن به تخم ماهی از طریق میکروپیل با میکروپیپت.....................

4-1- انتقال ژن از طریق اسپرم با انکوبه کردن آن در سیستم بافری...........

5-1- انقال ژن از طریق اسپرم با الکتروپورشن در سیستم بافری................

6-1- انتقال ژن  به تخم ماهی از طریق الکتروپورش.....................................

7-1-  انتقال ژن به تخم ماهی از طریق میکروپیل با میکرواینجکشن..............

8-1- بررسی امکان وراثت ژن منتقل شده به نسل ها بعد.............................

بخش دوم : دست کاریهای کروموزومی در ماهیان

1-2- دست کاریهای جنسی.............................................................................

1-1-2- دست کاریهای جنسی با تکنیک ژینوژنز............................................

2-1-2- دست کاریهای مجموعه کروزومی به وسیله تکنیک اندروژنز..........

2-2- پلوئیدی...................................................................................................

1-2-2- تریپلوئیدی.........................................................................................

2-2-2- تتراپلوئیدی........................................................................................

بخش سوم: کلونینگ

مقدمه................................................................................................................

1-3- ایجاد کلون به وسیله دوژینوژنز متوالی................................................

2-3- کلون کردن به وسیله ترکیبی از اندروژنز و ژینوژنز...........................

3-3- جابجایی هسته........................................................................................

4-3- جابجایی سلولهای سوماتیک جنینی به جنین دیگر.................................

5-3- دورگه گیری..........................................................................................

4- منابع............................................................................................................

بخش اول: دست کاریهای ژنی در ماهیان

مقدمه:

یکی از زمینه های که امروزه بیوتکنولوژیست ها روی آن تحقیق می کنند ایجاد گونه های ترانسژنیک است. طبق تعریف ترانسژنیک موجودی است که، دارای DNA  نو ترکیبی باشد. به طوری که در ژنوم آن موجود ژن نو ترکیب بیان می شود. بیان ژن خارجی یکی از جنبه های تولید ترانسژنیک و انتقال DNA به زاده های  هدف بعدی می باشد. در این زمینه تکنیک میکرواینجکش در انتقال ژن به تخم مهره داران اولین بار به وسیله گوردون (Gordon) و همکاران در سال 1980 گزارش شد. در این تکنیک یک لوله مؤئین شیشه ای را برای وارد کردن DNA نو ترکیب به پیش هسته نریا با سیتوپلاسم تخم لقاح یافته موش به کار گرفتند. در همین سال میکروانجکش مستقیم DNA نو ترکیب در شرایط آزمایشگاهی جهت ایجاد حیوانات ترانسژنیک مورد استفاده قرار گرفته است. طوری که ژن را از این طریق وارد تخم های لقاح نیافته یا لقاح یافته موجوداتی نظیر جنین توتیای دریایی،‌ موش،‌ قورباغه، مگس سرکه، خرگوش و خوک کرده اند (Brem 1988) در سال 1985 زئو (Zhu) و همکاران ژنی شامل پرتومتالوتیونین موش و ژن هورمون رشد انسانی را به ناحیه مرکزی صفحه زایای تخم های لقاح یافته ماهی طلایی تزریق کردند و قسمتی از این ژن را در DNA ماهیان مشاهده کرند. در همین سال روکونس (Rokkones) تکنیک میکرواینجکشن دو مرحله ای بر روی تخم آزاد ماهیان را شرح داده است. در این تکنیک ابتدا به کمک یک وسیله نوک تیز فلزی در قطب حیوانی سوراخی ایجاد شده و از طریق این سوراخ محلول حاوی DNA  نو ترکیب به کمک پی پت ریز تخم شدند به طوری که به کیسه زرده وارد نشوند. پس از 14 روز پلاسمیدهای کامل را مشخص کردند. چوروت (Chourrout) و همکاران در سال 1986 روش فوق را بر روی قزل آلای قهوه ای رنگ به کار برند با توجه به وجود DNA خارجی همراه با ملکولهای DNA میزبان پیشنهاد شده که این ژن به داخل ژنوم ماهی وارد شده است. محققان به ورش دستی یا از طریق هضم آنزیمی از  جمله با تریپسن کوریون را برداشته و تزریق میکرواینجکشن انجام دادند. در همین سال اوزاتا (Ozata) ماهی کوچک مدوکا را به عنوان مدلی برای ترانسژنیک مطرح کرد. او پلاسمیدهای حاوی ژن کریستالین جوجه را به هسته تخم ها از طریق میکرواینجکشن وارد کرد. به علت کوریون سفت در تخم لقاح یافته تعدادی از ماهیان استفاده از میکرواینجکشن مشکل و مستلزم اتلاف وقت زیادی است. به همین منظور  روشهایی جهت غلبه بر این مشکل به کار گرفته شده است. از جمله در سال 1988 بریم (Brem)  و همکاران ژن هورمون رشد انسان را به کمک وکتور مناسب از طریق میکروپیل به صفحه زایای تخم های تیلاپیا تزریق کردند و رشد بچه ماهیان طی 90 روز بررسی شد. مشابه این تحقیق توسط فلت چر (Fletcher) و همکاران در همین سال بر روی ماهی آزاد اتلانتیک انجام شد. همچنین تکنیکهای دیگر شامل الکتروپورشن (Electroporation) شلیک ذرات ژن Shatagun بر روی تخمک و طراحی لیپوزوم جهت ورود به زرده تخم انجام شده است. میکر واینجکشن نیاز به مهارت زیادی دارد و از طرفی سرعت آن کم و هزینه و تجهیزات آن زیاد است و مستلزم زحمات و زمان زیادی برای ایجاد تعداد زیادی از ما هیان ترانسژنیک است علاوه بر این از دیگر مشکلات آن این است که در تخم های القاح یافته اغلب ماهیان هسته به وسیله میکرسکوپ قابل روئیت نیست بنابراین DNA را به سیتو پلاسم  تزریق می کنند.

در مجموعه تحقیقات انجام شده، میزان باقی ماندگی جنین هایی که مورد تزریق قرار گرفته اند بین 50 تا 80 درصد گزارش شده است. و کارآیی میزان بیان ژن بین 3 تا 70 درصد بوده است. باقی ماندگی جنین ها و کارایی بیان ژن وابسته به فاکتورهایی نظیر سیستم بافری، غلظت DNA  و روش های مورد استفاده در تزریق می باشد. لذا در مراحل بعدی غلبه بر این مشکلات مورد توجه قرار گرفت به طوری که ضمن ساده کردن تکنک و کم کردن هزینه ها کارآیی را افزایش می دهند تا در عمل بتوان در تکنولوژی تکثیر و پرورش آبزیان تعداد زیادی از ماهیان ترانسژنیک را ایجاد کرد. بنابراین روش استفاده از اسپرم جهت انتقال ژن مطرح شد. اگر چه مفهوم بکارگیری اسپرم به عنوان یک ناقل مسئله جدیدی نیست بلکه در سال 1971 براکت (Brackett) با وارد کردن ژن خارجی به اسپرم خرگوش و در سال 1987 فریمن (Fareeman) بر روی ماکیان این تحقیق را انجام داده اند و در سال 1989 لویترانو (Lavitrano) این تکنیک را بر روی موش به کار گرفته است. در سال 1992 کهو (Khoo) تکنیک استفاده از اسپرم به عنوان ناقل را جهت وارد کردن ژنهای جدید به ماهی زبر به کار گرفت. همچنین در سال 1993 ایکسی (Xie) و همکاران جزئیات انتقال ژن از طریق اسپرم به کمک التروپورشن (Electroporation) بر روی ماهیان لوچ (Loach) و کاراس (Crucian) را شرح داده اند. در همان سال (سین) Sin و همکاران انتقال ژن به ماهی چنوک (Chinook) را با همین تکنیک شرح دادند. در  این نوشتار جزئیات دستکاریهای ژنی در ماهیان با ذکر مثالهایی بررسی شده است.

1-1- به کار گیری پروموتر از ژن ماهیان

گزارشهای اندکی در ارتباط با تحقیقات به کارگیری پروموتر از ماهی در دسترس است. در ماهی قزل آلای رنگین کمان دو فرم مشابه از ژنهای متالوتیونین بنام B,A وجود دارد. اگر چه پروموترژن B قادر به بیان  ژن  گزارشگر در محیطهای  کشت سلولی  است. ولی درباره این ویژگی پروموترژن B در سلولهای ماهی اطلاعات کمی وجود دارد. به منظور طراحی و کتورهای مناسب برای ما هی و مطالعه تنظیم بیان ژن در داخل بدن و شرایط آزمایشگاهی پروموترن ژن B متالوتیونین  ماهی قزل آلا جدا شد. پس از PCR نقش آن در بیان ژن در لاینهای سلولی انسان و ماهی توسط هونگ (Hong) به کار گرفته شد. به همین منظور وکتور بنام PtMTb – CAT که دارای 6/4 کیلوباز است طراحی گردید. حدود 261 حفت باز وکتور مربوط به پروموترژن B متالتیونین قزل آلای رنگین کمان (tMTb) کیلو باز آن ژن کلرامفنیکل استیل ترانسفراز (CAT) و سیگنال پلی ادنیلاسیون ویروس SV40 و همچنین 7/2 کیلو باز آن قطعه ای مربوط به پلاسمید PUC₁₈ بوده است همچنین طراحی آن بر پایه ساختمان pBL – CAT تکمیل شده بود. به طوری که طراحی BL پرایمری دارای سکانس اولیگونکلئوتیدی بر اساس ردیف نکلئوتیدهای سمت 5 از 250 تا 221 ژن MTb ماهی قزل آلا بوده و دارای محل ویژه ای جهت برش توسط آنزیم EcoRI بوده است. همچنین در ساختمان پلاسمید ptMTb – CAT قطعه 261 جفت بازی پروموتر tMTb در جلوی ژن CAT در ساختمان  CAT pBL- قرار گرفته است. در کنار این چهار وکتور دیگر طراحی گردید، که شامل pBL-CAT₂-1 که در آن پروموتر تیمیدین کیناز (TK) ویروسی در بالا دست ژن CAT قرار داده شده بود. pBL-CAT₃-2 بر اساس pBL-CAT₂ که در آن پروموتر TK برداشته بود طراحی شد pTK-CAT₂E-3  که در پلاسیمید PBL-CAT₂ تعداد 72 جفت باز تکراری از اینهنسر SV40(Enhancer) به صورت دوبل به ابتدای ژن CAT اضافه شده بود. PhMT IIA-4 که تعداد 850 جفت باز دارای محل ویژه برش Hind III/NcoI از پروموتر آن متالوتیونین II_A انسانی (Hmt_IIA) به ژن CAT در ساختمان
 pBL-CAT₃  اضافه شده بود این وکتورها به روی 4 لاین سلولی ماهی و یک لاین انسانی به کار گرفته شدند. طوری که در آن سلولها با میزان 5/3 پیکومولار از DNA پلاسمید آلوده شدند جزئیات نتایج در جدول شماره یک آمده است.

جدول 1- سنجش فعالیت پروموتر در یک لاین سلولی انسان و چهار لاین سلولی ماهی

4-3 – جابجایی سلولهای سوماتیک و جنینی به جنین دیگر

هو (Ho) و کان (Kane) در سال 1990 موفق به انتقال سلولهای نشانه گذاری شده طبیعی و جهش یافته ماهی زبرا به دیپلوئیدهای گیرنده شدند تا چگونگی اثر آنها را مطالعه نمایند. لین (Lin) و همکارانش به طور موفقیت آمیز 20 تا 100 سلول رنگ دانه ای یکسان ماهی زبرا را به سلولهای بلاستودرم البینو (فاقد رنگدانه ) گیرنده آن تزریق کردند 23 تا از مجموع 70 تا تالبینو که به آنها سلول رنگدانه ای منتقل شده بود پس از 4 تا 6 هفته شیمریک ( موجود دارای دو ویژگی متفاوت ) و 18 درصد از سلولها فقط رنگدانه داشتند. آزمایش مشابهی به وسیله نیلسون (Nilsson) و کلود (Cloud) در سال 1992 روی قزل آلای رنگین کمان انجام شد. بر طبق نتایج بدست آمده 1000 سلول نشانه گذاری را تزریق کردند که فلورسانس (نشانه) در 19 تا از 114 جنین شمریک یعنی به میزان 17 درصد دیده شده است. الگوی توزیع سلولها به طور گسترده ای در جنین شمریک پخش شده بود.

هروت ( Horvath ) و همکارانش سلولهای توتی پوتنت کپور دیپلوئید در مراحل مرولا یا بلاستولا را به یک جنین در مرحله 3 تا 4 سلولی منتقل نمودند تا با نمونه ها دیپلوئید طبیعی مقایسه نمایند. مشاهده شده که، میزان هاپلوئید برای این منظور مناسب تر است.

برای انجام این انتقال یک کارشناس می تواند در عرض یک ساعت تعداد زیادی از اینها را ایجاد نماید و موفقیت این تکنیک را می توان با یک کارکرژنتیکی ثابت کرد برای این منظور از مطالعه فلس استفاده شده سلولهای گیرنده هاپلوئید از یک ماهی ماده نقره ا بدون فلس (SSnn ) در نظر گرفته شد. در ضمن اینکه سلولهای دیپلوئید دهنده از زاده های ناشی از تلاقی یک نر فلس دار(SSnn ) و یک ماده فلس دار (Ssnn و SSnn)  در نظر گرفته شده اگر بین زاده های ایجاد شد بچه ماهیان دارای فلس وجود داشته باشند این نشان می دهد که صفت از دیپلوئید دهنده منتقل شده است اگر چه این آزمایش موفق نبوده است ( تصویر 19).

تصویر 18- فرآیند جابجایی هسته در ماهی بالا: خارج کردن هسته از تخم ماهی (a) : جایگاه جسم قطبی و هسته (b) :  ورود سوزن شیشه ای به سیتوپلاسم در جایگاه هسته (c): هسته به وسیله سوزن برداشته شده پایین : جابجایی هسته به تخم ماهی فاقد هسته (a): یک جنین بلاستولایی (b) جداسازی سلولهای بلاستولا در محیط فاقد کلسیم (c): یک هسته از سولولها با پیپت مکش می شود (d) : این هسته با میکرو پیپت به تخم فاقد هسته تزریق می شود.

تصویر 19- سیستم کلونینگ امکان پذیر با استفاده از سلولهای کپور معمولی در جنین مرولایی و بلاستولایی (1) ایجاد تخمک گذاری ژنوتیپ ماده ssnn (آئینه ای ) (2) لقاح (3): کورون زدایی با پروتئاز در مراحل اولیه جنینی (4): جدا کردن سلولهای جنین مرولایی بلاستولایی (5): افزایش سلولها در جنین میزبان 6- انکوباسیونو و مراقبت